药品连续制造（Continuous Manufacture，CM）是重要的新型技术之一，在提高生产效率和降低生产成本方面有巨大的潜力。随着2021年7月ICH发布Q13指南草案，药品连续制造监管已经进入新的时代。
细胞培养工艺强化的目标是提高单位体积生产率，一般通过提高活细胞密度（VCD）、细胞特异性表达量（QP）以及提高生物反应器生产中的利用率（包括减少非生产性生物反应器周转阶段以及生产率较低的细胞生长阶段和后期生长阶段）来实现。目前，灌流生产已成功用于生物加工领域，然而由于其在工艺开发和过程表征方面的挑战、对自动化和建模要求较高的复杂操作要求，以及现有大多数生产厂房设施主要适用于传统Fed-batch等原因，灌流培养工艺在哺乳动物细胞培养工艺商业化生产中的占比仍不足10%。为了尽可能地实现连续工艺的优势，各类多元化的连续流模式应运而生。
图1. 工艺强化和连续生产推动空间利用率的提高
利用灌流技术进行上游工艺强化已经在提高生物生产产量以及降低成本方面显示出了极大的潜力，并且同时提升培养空间利用率 (图1)。以BMS为例，其研究人员使用CHO细胞生产单抗 (图2)：传统工艺方案（工艺A），优化后工艺方案（工艺B）和2000 L 规模（工艺C）强化工艺方案。对于上游部分，通过富集N-1种子培养液（工艺B）或以灌流模式操作N-1步骤（工艺C），进行强化种子培养方案，以提高生产生物反应器N级前的种子培养步骤（N-1）的细胞密度。N-1步骤更高的最终细胞密度可显著提高以补料分批模式操作的生产生物反应器的接种密度，从而显著提高滴度。
和工艺A相比，工艺B的滴度增加了4倍，工艺C则增加了8倍，同时可维持相当的最终产物质量。针对上游工艺的改变，下游工艺也可以进行亲和连续捕获以及AEX-CEX半连续洗脱方式的开发，综合提高纯化效率，有效降低填料使用量；针对同步产生的COF分析显示，从传统工艺A转变为强化工艺C，耗材成本降低了6.7 -10.1倍。
图2. 灌流工艺开发技术路线[4]
Process A（传统1000-L工艺），Process B（富集强化的1000-L工艺）, Process C（N-1灌流强化型2000-L工艺）
东曜药业CCPD （Cell Culture Process Development）平台在原有的PB-Hybrid专利技术基础上，结合具体项目，重点开展N-1级高密度种子制备技术拓展，进行N级高密度接种Fed-batch培养技术及N级浓缩型灌流培养技术研究（技术路线如图3所示），提高产量，且保证产品质量属性不变。
图3. CCPD灌流工艺开发技术路线
种子扩增强化可提高工艺的灵活性和可放大性。使用细胞截留设备，在N-1采用高密度的连续灌流培养，为1:5~1:20体积放大的N阶段连续提供细胞种子，减少多级种子罐的固定资产投入，增加厂房布局灵活性（图4）。
图4. N-1级种子灌流培养示意图
在项目A中，N-1级种子细胞经过7天灌流培养，密度达到80~100×106cells/ml，细胞活率＞98%；使用该种子细胞以接种密度为0.5×106cells/ml进行N级反应器接种，经过Fed-batch培养验证，得到的蛋白表达量与传统种子链Fed-batch工艺蛋白表达量一致，相关质量没有明显差异（图5）；该工艺的稳健实施证明该模式制备的种子同样具备较高的活力；同时，针对同一产品的大规模生产，为Scale-out模式扩大化生产提供技术解决路线。
图5. N-1级灌流制备高密度种子后常规Fed-Batch细胞生长及相关质量
在过去，提高产量的主要因素是综合活细胞密度（IVCD），多年来，IVCD一直在增加，其主要通过两种策略：第一，通过培养基优化，延长生长期，以达到更高的峰细胞密度；第二，通过优化补液和工艺参数，提高活性，从而进一步延长工艺运行。
最近研究提出流加批次细胞培养工艺强化的概念，通过实施N-1灌流培养，可将生长和生产分开，从而为工艺开发提供多个优势；可实现N级（3~20）×106cells/ml的高密度接种。相比传统流加补料工艺，使用高接种密度开始补料批式培养，降低补料批式培养持续时间的策略，是一种提高生产能力、且不需要对生产生物反应器做任何改动的高效策略。
在东曜药业执行的项目A中，利用灌流在N-1级制备高密度种子，以20.0×106cells/ml进行N级反应器接种，经过12天的流加培养，收获时蛋白表达量是传统Fed-batch培养蛋白表达量的2倍左右，同时相关质量没有明显差异（图6）。
图6. 强化分批补料工艺细胞生长及相关质量
浓缩型灌流培养，使用30-50kD的超滤组件，使得目的产物和细胞一起截留在罐内，培养结束后，一起收获，这种方式跟补料分批方式相似，所以也称为浓缩补料分批（Concentrated Fed-Batch，CFB），其连续灌流的方式更加简单，不涉及产物的多个“亚批”收获以及批次及产物一致性的鉴定问题，是在固定体积反应器内，短时间实现产品“超常”产量的简单方式。
同样在项目A中，N级前期通过3~5天基础培养基灌流，中后期使用灌流培养基灌流10~15天，同时截留细胞和蛋白，密度峰值达到（80~100）×106cells/ml，细胞活率维持在80%以上，最终收获时蛋白表达量是传统Fed-batch培养的7倍左右（图7）。
图7. N级浓缩型灌流培养细胞生长及相关质量
即便是能够较好的在不同项目中进行技术应用，但针对技术应用的晚期研究以及对于长周期或者不同培养状态下目的产物的关键质量属性一致性研究等方面均存在一定的难度工作。
（1）成熟的小体积模型（Scale-Down Model）的开发
优良的小体积模型的开发，可以在优化工艺时降低生产成本，提高筛选效率。目前经常使用的灌流培养的小体积模型有深孔板、摇管等，此类模型不能完全模拟实际生产过程中连续换液和连续收获的操作，不能很好地反馈目的产物收获时对中空纤维柱滤膜的堵塞作用，同时该模型没有pH和溶解氧的实时控制，并不能完全模拟灌流培养中细胞的生长和代谢状态，不能满足高密度下对于气体交换以及废弃物进出的需求，作用较局限。
（2）目的产物关键质量属性调控方法的开发
糖型和电荷等的变化均会影响蛋白类药物的有效性及在体内的免疫原性，尤其是在生物类似药的研发和申报时，对质量的调控显得更为重要。然而目前关于调节产物质量的文献报道多是基于传统的批次培养工艺，针对培养模式和细胞代谢状态有别的灌流培养工艺，开发出特有的更有效的调节质量策略仍是难点。
（3）“亚批”收获产物之间质量一致性的保证
灌流连续培养的工艺周期较长（一般> 30天，甚至达到数月），培养期间目的产物连续收获。尽管认为在灌流培养过程中，由于营养的相对丰富，细胞生活环境处于稳定状态，但随着细胞倍增次数的增高（对于细胞株的稳健性提出更高的要求），细胞代谢状态可能发生改变，进而影响到目的产物质量的一致性。
（4）区别于传统工艺的全生命周期研发工作
灌流培养工艺周期较长（对于早期的项目而言，时间成本尤为重要）、设备使用专业要求高、操作复杂（对于人员的技术背景和实验素养要求更高），且业内无绝对的标准化开发流程，可变因素较多，需要的资源整合能力较强，如何实现从头到尾全要素的完善对于开发工作有着巨大的挑战。
尽管面临较多的挑战，但对于未来工厂和工业4.0的不断探索，促使连续工艺的持续发展，极大的丰富了灌流培养工艺开发能力，也为早期已上市产品如何提高市场竞争力提供了方向。
N-1级灌流制备种子，与传统种子链方式相比，培养基消耗相似，能够减少种子罐，厂房规模投入，但是需要增加ATF设备及相关耗材，工艺复杂程度相对增加；N级浓缩灌流培养能够带来较大的蛋白提升，但同时也需要消耗大量的培养基；N级强化分批补料工艺相比N级浓缩灌流培养，增加较少的培养基消耗却能带来较大的蛋白提升，各种新型工艺路线均存在相应的优缺点，不同的生物制药公司结合自身实际情况，进行不同的工艺路线选择，综合考虑培养基消耗，设备投入带来的蛋白产量的提升，最终实现产能的提升以及成本的降低。
东曜药业工艺开发团队在CCPD（Cell Culture Process Development）技术平台基础上，结合项目实际需求以及综合厂房设施设备现状，开展不同工艺路线的创新研究，用于不同的细胞培养工艺开发；从工艺开发到商业化规模生产，支持CDMO项目工艺开发多元化、产品产业化等服务需求。
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参考文献
[1] Chen C, Wong HE, Goudar CT (2018) Upstream process intensification and continuous manufacturing. Curr Opin Chem Eng 22:191-198.
[2] Jianlin Xu*, Matthew S. Rehmann，et al. Development of an intensified fed‑batch production platform with doubled titers using N‑1 perfusion seed for cell culture.
[3] Seungsun Lee, Chunggeun Lee. Large-scale continuous biomanufacturing: utilizing N-1 technology for higher productivity and quality, 2022.
[4] J.Xu, X.Xu, C.Huang, et al., Biomanufacturing evolution from conventional to intensified processes for productivity improvement: a case study. MABS, 2020, 12 (1): 1-13.